Lily’s Notebook

AUTHORLily

PUBLISHED2026-07-01

Reference

ATP和-OH反应过程：9.4: ATP, The Principal Phosphate Group Donor

amino acid table: All About Amino Acids

kinase磷酸化过程：Mechanism and Catalytic Site Atlas

上面的网页还有别的mechanism的解释，网页：Mechanism and Catalytic Site Atlas

kinase结构：Just a moment...

药物抗性：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c00361

Amino acid table

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aa磷酸化&ATP

Serine, threonine, tyrosine, 特点是都带-OH

ATP里的三个P，根据离ribose的距离，依次为Pa(alpha), Pb(beta), P(gamma)

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夺取gamma的phosphate，就需要用Mg2+去中和最边上两个phosphate的负电，目的是不让phosphate排斥-OH的O

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也可以attack beta 和 alpha

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Nucleophilic attack 亲核攻击

Lone pair，孤对电子

Lone pair（孤对电子）是指：氧、氮、氟等原子最外层上没有用于成键的电子对。

它们属于原子自己，不和别的原子共享电子。比如下面这个，外面4个点点，形成2个lone pair，然后和H的2个成键电子对

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所以对应的就是bonding pair（成键电子），两个原子共享电子对，形成covalent bond（共价键），比如O-H, C-O, C-H

-O（氧负离子，或者-OH中的氧）有孤对电子（lone pairs）。这些孤对电子上带着高电子密度（很多电子，电子云很密），可以主动去攻击电子不足（带正电）的原子，比如磷酸基里的P、或者碳正离子C⁺。

这种用自己的孤对电子去进攻、形成新键的行为，就叫亲核攻击（nucleophilic attack）。

为什么会攻击phosphate里的P？

在ATP里的phosphate（比如三磷酸腺苷ATP）：

磷（P）和**四个氧（O）**相连。
其中有些氧通过P=O的双键连接，有些是P-O单键，有些O带负电（O⁻）。
磷本身整体上是中性的（即P并没有真正带正电荷）。

**但是！**即使没有形式上的正电荷，磷的电子是相对“贫电子”的（电子密度不足）。

因为：

氧（O）的电负性（electronegativity）比磷（P）大很多。
电子更偏向氧，被氧拉走了。
结果，虽然整体是中性，但磷局部变成了一个“电子密度低”的原子。
也就是，它在化学反应中，表现得像是“带一点正电性质”，容易被亲核试剂攻击。

这种情况我们叫做局部正电荷（partial positive charge, δ⁺），用这个符号表示 δ⁺（不是正式+1，是一点点正电倾向）。

过程

准备阶段： -OH基团中的氧（O）上有孤对电子，可以向电子贫乏的磷（P）发起攻击。磷酸的磷原子有一个P=O双键和三个P-O单键，其中有些氧是带负电荷的。
亲核攻击（Nucleophilic attack）： -OH的氧原子用它的一对孤对电子，攻击磷原子，在P和O之间形成一个新的P-O键。
过渡态形成（Transition State）： 此时，磷周围暂时会连接5个原子（五配位过渡态，五角双锥结构，称为pentavalent intermediate）。由于五配位结构不稳定，系统要尽快分解。
键断裂（Leaving group departure）： 为了缓解过渡态的高能量状态，原先与磷连接的一个P-O键会断裂，通常是把一个氧原子连带一部分磷酸基团**作为离去基（leaving group）**甩出去。
氧氢断裂同步（Proton transfer）： 同时，为了维持中性或负电性平衡，原本-OH中的O-H键也会断裂。氧带走成键电子（所以变成O⁻），而氢则作为H⁺（质子）离开。有时候，这个H⁺会被周围的溶剂（比如水）或者附近的碱性基团（如酶里的氨基酸残基）接走。
最终产物（Product formation）： 最终，新的P-O键形成，连接了原来-OH所在的分子和原来的磷酸。另一个部分（比如一个磷酸或焦磷酸）作为离去基释放出来。整个反应是一个**磷酸酯化（phosphorylation）或者磷酸转移（phosphate transfer）**过程。

kinase 结构

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Defining a new nomenclature for the structures of active and inactive kinases

kinase domain整体上可以分为两个部分，上面接近N terminal的叫N-lobe, 主要由beta-sheet构成，下面接近C terminal的叫C-lobe，由alphaC-helix螺旋状蛋白构成。

我一般喜欢让C-helix对着我，放在右侧，就类似图中的位置。

另外从视觉上来讲，b5在b4的前面，是因为b4的序列在前面，只不过空间上比b5靠后。

aC-helix两端连接的部分和β的名字相关，αC–β3 loop 和αC–β4 loop。很多药物突变会发生在αC–β4 loop。

P+1 loop

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决定substrate peptide position 0 acceptor的性质

ATP pocket

然后左侧上下两个部分连接的位置是ATP pocket。很多covalent药物小分子喜欢target这个位置，一般会carry acrylamide, 也就是C=O C=C。里面的C beta，就是双键右侧的C，会和附近的cysteine的-S产生共价键，S-C。

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ATP pocket里，包括hinge上游的gate keeper里，T790M 就在这里，这个突变可以让ATP更好的结合，还会阻碍第一代EGFR药(gefitinib/erlotinib)的结合，从而使得靶向药无效，是最common的acquired resistance ，但是osimertinib可以overcome this resistance。

K in aC-helix

在未激活状态，它处于“αC-out”构象（偏移、向外旋出）
在激活状态，它变成“αC-in”构象（向内靠近活性位点）

一些磷酸酶在激活之后，aC-helix会由外往里走。

比如EGFR激活之后，EGFR activator 把EGFR receiver的aC-helix往里推，然后就会就会让beta-3上的lysine(K)和aC-helix上的E（glutamate)形成盐键。在这里，EGFR的A loop并不是作为必须条件激活EGFR的。

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pdb: 2GS2, An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor

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2009 John Kuriyan: Mechanism for Activation of the EGF Receptor Catalytic Domain by the Juxtamembrane Segment

Juxtamembrane

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D in DFG motif in activation loop

DFG motif是由氨基酸D,F,G构成，在activation loop里面（activation loop的开头，结尾是APE motif），DFG的D是用来hold住Mg2+，中和ATP中phosphate里O的负电帮助s/t/y的OH抢夺磷酸基团。

DFG in 就是active (in 是需要hold住Mg2+），DFG out就是inactive。

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上面蓝色是in，紫红是out，中间的橙色是intermediate。

in离C-helix的近，所以D1小（图C x轴），但是离b3-K远，所以D2大（图C y轴）。反之就是out。

DFG-in: activation loop 在里面，activate state，更容易hold住Mg2+。这个状态由activation loop的磷酸化来控制。BRAF V600E就是发生在activation loop上的，使得BRAF持续active, E(glutamate) COO-带有负电荷，模仿磷酸化的状态，并且左右两侧是T599 和S602。EGFR 的L858R 也在a loop上，不过R带正电荷，可以和附近酸性的氨基酸形成氢键或者salt bridge,使得a loop固定在了activation （in）的位置，于是就持续active了。

DFG-out： activation loop在外面，inactive state

D in HRD motif in catalytic loop

catalytic loop里的HRD motif，是由氨基酸H,R,D构成，D用来抢夺substrate里s/t/y 的-OH中的H。帮助O去attack phosphate里的P

P loop

beta-1 和beta2相连的部分是p-loop，就是下图中橘黄色的部分。

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K in VAIK motif in beta3 sheet

beta sheet-3 上有一个VAIK motif, [V/I]-A-[V/I]-K (valine/isoleucine)-alanine-()-lysine。这里面的K就是beta3-lysine。

beta3-lysine -NH3+（带正电）可以和aC-helix上的E (gluatmate) -COO-（带负电）形成salt bridge，稳定ATP binding pocket的结构。

同时，beta3-lysine -NH3+可以和ATP中的phosphate形成氢键。这里注意，aC-helix上的E不会直接和ATP接触，而是通过和lysine的NH3 interact来稳定lysine的结构，好帮助lysine更好的fix ATP。

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EGFR K745 VAIK E762 ILDEA

HER2 K753 VAIK E770 DEAY

inactive的时候，aC上的E就不会冲着里面，而是向着别的方向。

substrate site

substrate的地方，example是5czh, 橘黄色的部分就是substrate peptide，伸出来的是phospho-tyrosine

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另一个例子，可以看到ATP和substrate很近，传达磷酸基团。

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https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674%2806%2900584-8

pseudo kinase

pseudo kinase(PK)很多时候就是缺少这些motif里的一些氨基酸，但并不意味着它们没有功能。

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比如Jak1蛋白有两个kinase domain，一个是PK,一个是function的TK。

PK可以形成dimer，然后激活TK 。如果没有PK，JAK1单独在细胞表达会一直处于激活状态，但当PK-TK作为一个整体表达的时候，JAK1会autoinhibit，所以PK是类似一个开关来调节JAK1的激活状态。

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Structure of a Janus kinase cytokine receptor complex reveals the basis for dimeric activation

图里的PK是头对头，如果上面的linker发生oncogenic突变，突变会促进dimer，使其一直处于激活状态。

C terminal 尾巴

有些磷酸酶有很长的尾巴，在C-lobe后面，比如EGFR，尾巴可以被磷酸化，然后吸引含有SH2,SH3,PTB domain的蛋白来bind，然后激活后面的路径。

比如下面这个例子。EGFR磷酸化尾部 Y1068被磷酸化后，Grb2通过 SH2 域结合，Grb2 的两个 SH3 域像“手”一样把 SOS 拉过来，SOS 是一个 Ras GEF，它在膜上接近 Ras，使 Ras-GDP → Ras-GTP。

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The Grb2 isoform, Grb3-3, negatively regulates Ras activation

药物

type 1 inhibitor

针对ATP pocket，通常是active form，DFGin

type 2 inhibitor

target allosteric pocket，在aC helix下面，通常是inactive form，DFGout

药物抗性

exon20 insertion

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her2

就在aC-helix前后的部分。以her2作为例子，最常见的是Y772_A775dup, 然后是G776delinsVC。它可以让HER2持续激活，是因为它能maintain activation的状态。

gate keeper - hinge - solvent front

gate keeper (GK)就是图中紫色的部分，hinge的上面，常见的氨基酸是M,T,L,F。

solvent front 在hinge(连接N lobe和C lobe的地方）的后半部分，挨着C lobe的部分。它一般有4个氨基酸组成的motif （SF），其中SF-3（G）是最common的。

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大部分的磷酸酶在SF-3的地方都是G（下图）。最常见的solvent-front突变就是G to X。G是氨基酸里最短最简单的，换成别的氨基酸会导致空间上的冲突(steric clash)。比如上图的B

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下面是一些磷酸酶的solvent front。大部分的SF3都是G，所以可以提前预测药物的抗性。

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SF3-G空间冲突

很多药会在某个集团与solvent front中G的突变产生冲突。

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SF4空间冲突

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SF4-C突变

形成共价键的C的突变。注意SF-4, BTK, EGFR, ITK, BLK是cysteine，可以和共价药物产生共价键。但大部分的病人会在treatment后产生cysteine的突变。突变一般倾向于一个less reactive serine，或者变成一个更大的氨基酸，比如R,F,Y。下面highlight的官能团是可以形成covalent bond的。

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